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本制品是甲基化DNA修饰及PCR扩增试剂盒，既适用于实体材料和悬浮细胞，也适用于纯化好的DNA样品。

• 用包埋的DNA进行所有操作，免去所有沉淀和纯化步骤，极大简化了操作。
  
• 包埋中的DNA在整个操作过程中都处于单链状态，提高了修饰效率。
  
• DNA在包埋块中，切换反应液不但非常方便，而且DNA回收率都在90%以上。
  
• 本试剂盒足够制备150多个10μL包埋块（如果用纯化好的DNA）或25个10μL包埋块（如果用悬浮细胞）。
  
• 本制品仅适用于科研。

• 在装有2.3g甲基化修饰溶液B成分一干粉的棕色瓶中加入3.9mL水和0.9mL甲基化修饰溶液A，摇晃溶解得到4.8mL溶液B成分一。
  
• 在装有110mg溶液B成分二干粉的离心管中加入1mL 50℃预热的超纯水，摇晃溶解，得到溶液B成分二。
  
• 将0.6mL溶液B成分二加入到4.8mL溶液B成分一中，得到5.4mL溶液B工作液，冰上放置待用。未用完的溶液B工作液不得再使用。
  
• 每次实验前，将装有1.5mL包埋液的离心管在沸水浴上放置数分钟直到变成溶液，然后放80℃待用。
  
• 用常规的胰酶消化法处理动物实体组织或培养细胞，得到浓度不超过60个细胞/μL的单细胞PBS悬液。如果实验材料已经是单细胞悬浮液（如卵细胞），则PBS洗涤后直接离心沉淀，再重悬在PBS中（浓度不超过60个细胞/μL）。
  
  本试剂盒不含本步所需相关试剂，如胰酶消化液和PBS。
  
  
• 在一个自备的2mL离心管中加入3μL上步所得细胞悬液，再迅速滴加7μL在80℃预热的包埋液，共得10μL包埋液-细胞混合液。
  
  不需要吹打混匀以免混合液在抢头里面凝固。
  
  
• 加入500μL分子生物学级石蜡油确保后续处理过程中溶液不会蒸发。短暂离心确保10μL包埋液-细胞混合液沉到管底。
  
• 将离心管在沸冰浴中放20分，此步可将DNA分子变性成单链。
  
• 将离心管转移到冰上放置30分钟，包埋液-细胞混合液将凝固成10μL的包埋块，包埋块中将包含细胞的基因组DNA和蛋白质组份。
  
• 在包埋块中加入500μL包埋块裂解液和5μL蛋白酶K溶液（10mg/mL），短暂离心后37℃保温过夜。此步将降解包埋块中的蛋白质组份。
  
• 吸弃包埋块之外的所有溶液（包括石蜡油）后，分别用1mL TE缓冲液室温浸泡包埋块2次，每次15分钟。此步可去除残留在包埋块中的裂解液和蛋白酶K。
  
• 酶切包埋块中的基因组DNA：选定不识别PCR靶片段的自备内切酶，再用此酶对应的100μL 1×酶切缓冲室温液浸泡包埋块15分钟，吸弃该缓冲液后再加入100μL 1×酶切缓冲和50U的内切酶，37℃保温2小时后吸弃内切酶反应液。
  
• 加入500μL新鲜配制的处理液A，室温放置15分钟后吸弃处理液A。
  
  处理液A配制方法：100μL DNA甲基化修饰溶液A加400μL超纯水。
  
  
• 重复上步一次。此时DNA将呈单链。
  
• 加入1mL新鲜配制的处理液B（不是溶液B），室温浸泡包埋块5分钟后吸弃处理液B。
  
  处理液B配制方法：50μL DNA甲基化修饰溶液A加950μL超纯水。
  
  
• 加入750μL石蜡油，然后沸水浴30秒，使DNA变性。
  
• 将离心管转移到冰上放置30分钟使包埋块重新凝固，单链DNA将固化。
  
• 在离心管中加入1mL在第3步预冷的溶液B工作液，短暂离心后继续在冰上放置30分钟。此步用于修饰固化的单链DNA。
  
• 将离心管转移到50℃放置3.5小时后吸弃溶液B工作液。
  
• 分别用1mL TE缓冲液常温洗涤包埋块2次，每次15分钟，吸弃TE缓冲液。
  
• 分别用500μL新鲜配制的处理液C（50μL DNA甲基化修饰溶液A加450μL超纯水）常温洗涤包埋块2次，每次15分钟，然后吸弃处理液C。
  
• 用1mL TE缓冲液常温洗涤包埋块3次，每次10分钟，然后吸弃TE缓冲液。
  
• 所得包埋块可以在4℃保存数月待用，也可以用超纯水洗涤两次（每次15分钟）后直接用做20μL体系甲基化PCR的模板。
  
• 如果样本是纯化好的DNA溶液，先用不识别PCR靶片段的合适内切酶酶切DNA，总体积不超过20μL，DNA不超过700ng。本试剂盒不提供所需内切酶。
  
• 酶切结束后，沸水浴10分钟灭活内切酶并变性DNA。
  
• 冰上放置并短暂离心数秒后，加4μL DNA甲基化修饰溶液A，50℃保温15分钟。
  
• 迅速加入50μL在80℃预热的包埋液，用手指快速弹击管底混匀溶液并继续放80℃待用。不要吹打混匀以避免包埋液在移液枪头中凝固。
  
• 在一个新的2mL离心管中，加入1mL第3步预冷的溶液B工作液，再加上750μL石蜡油，短暂离心后将离心管放冰上预冷。
  
• 迅速取80℃保温的混合液10μL（第27步），用在空中滴加的方式加到第28步准备的预冷离心管中，滴加的混合液遇冷将迅速在石蜡油中形成一个包埋块。
  
  不要将枪头浸入到预冷的溶液中，否则包埋液将迅速在枪头内凝固。如果包埋块没有沉到管底，可以用枪头将其拨到石蜡层下面的液相中。
  
  
• 再重复上步操作6次，共可以得到7个包埋块（每块约含100ng DNA）。
  
• 将离心管（含7个包埋块）继续放冰上30分钟进行修饰。
  
• 后续操作同第19～23步。
  
• 改成按下表加入各成分。
  

  成分	甲基化管	非甲基化管
  2×Probe qPCR MasterMix	10μL	10μL
  10μM甲基化DNA PCR引物	2μL	不加
  10μM非甲基化DNA PCR引物	不加	2μL
  待测DNA样本	7μL	7μL
  超纯水	至20μL	至20μL

  
  
• 95℃预变性10分钟;（95℃变性45秒、58℃ 45秒、72℃退火45秒）35次循环;最后72℃延伸10分钟结束后取5～10μL配合上样缓冲液使用，上样电泳。
  
• 取10μL加自备上样缓冲液后电泳并分析实验结果。